激光片层荧光显微系统(LSFM)将荧光激发与检测分割成两个独立的光路，检测轴线与照明轴线垂直。也就是说，您可以同时照亮样品内部很薄的一个层面，只激发这一层面的荧光，从而产生一个内源性的光学切面。不需要针孔或者特殊的图像处理。来自于焦平面的荧光通过相机靶面一次成像，而不是像共聚集或者其他激光扫描显微镜那样逐点成像。与其它显微镜技术相比，基于相机靶面检测器的并行图像采集更快速，且所需的激发光强更小。总而言之，LSFM将光学切面效果与焦平面图像的并行采集相结合，令三维成像达到很快的速度，且大大提高了光效率。

将检测光学器件从照明光学器件中分离出来，这样就能用低数值孔径的专用透镜进行荧光激发，而不会损失检测图像的分辨率和灵敏度。这使得LSFM成为毫米级样品成像的理想选择，例如，正在发育的生物体或者大型的透明化组织样品。