药物研发，特别是单抗药、重组蛋白等新型药物的开发实践，对于蛋白以及蛋白生物标志物检测提出了很高的要求。新型的Erenna单分子免疫检测技术以其对蛋白标志物超高检测灵敏度，大动态范围，灵活的实验方案和可自行开发检测试剂盒等特征获得了全球众多著名制药公司的青睐，包括艾伯维，辉瑞，诺华，默沙东，默克雪兰诺，罗氏，GSK，杨森，欧陆（Eurofins），第一三共制药等等。甚至美国FDA也将Erenna单分子免疫检测技术作为新药审查的重要依据，已经广泛应用于新药的药动学，药效学和安全评价工作。Erenna单分子免疫检测技术究竟是怎样的一种全新方法？在制药领域有哪些有价值的应用？能够给中国的药物研发带来怎样的启示？本文将试图为以上问题提供清晰的线索，以期待新技术为药物研发打开新的局面。
SMC单分子免疫检测技术
单分子检测技术是默克在2015年夏天推出的生物标志物检测技术。并且在2017年上市新的SMCxPRO单分子系统，使得研究者可以实现无以伦比的灵敏度（通常情况下为ELISA的100-1000倍）检测生物标志物，并且这项技术在与ELISA易用性相近的同时，还能帮研究者节约样本用量，乃至实验经费。这项新技术为以前难以检测的生物标志物重新打开了研究大门。
SMC单分子检测技术利用经典的双抗免疫夹心法，使用针对于同一个抗原不同表位的两种抗体来完成检测。捕获抗体包被在多孔板或者磁珠上，检测抗体同荧光标签偶联。所采用的实验步骤与夹心法ELISA很相似，但是在信号获取方面与ELISA存在根本区别：在检测步骤之前，利用洗脱缓冲液来解离免疫复合物，洗脱物被转移到新的384孔板，将板放入SMCxPRO系统，系统所产生的激光高能光斑能够最有效地照射和激发单个荧光分子。SMC™单分子检测专利技术会检测区域的单个荧光信号，峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号，并将检测到的数字信号进行汇总，显著地提高了检测灵敏度。因此这项技术被命名为“单分子检测”，真正在生物标志物检测方面做到了单分子水平，在现有抗体依赖生物标志物检测领域做到了极致。
图一、SMC单分子免疫检测的工作流程
图二、单分子免疫检测原理
应用实例一、SMC技术在脊髓性肌肉萎缩症的药物研发应用
脊髓性肌肉萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）是非常危险的致死性神经肌肉疾病。在美国，欧洲和日本大约有30000-35000个病患，约1/50的人有这个隐性基因携带。该疾病是常染色体隐性遗传病，由Survival Moter Neuron(SMN)蛋白下降引起，会导致肌肉无力，萎缩，甚至瘫痪。是导致婴儿死亡的主要遗传因素。病发时脊髓前角细胞运动神经元变性，造成患者近端肌肉对称性、进行性萎缩和无力，最终引起呼吸衰竭甚至死亡，在致死性常染色体遗传病中排名第二。
目前在治疗领域取得最重要突破的药物是nusinersen，由Ionis制药公司（原ISIS公司）开发。机理通过反义核酸序列，调控SMN2前体mRNA的剪接,增加第7外显子的接入来增加SMN蛋白的表达。最初的药效检测方式使用RT-PCR的方法在小鼠等模式动物中枢和周围神经系统来检测药物处理的效果，但是通过这种方式来进行药效学的判断非常困难。SMN蛋白的定量对于判断药效是更直接的选择，但是传统酶联免疫方法得到的前期数据显示脑脊液中的SMN蛋白会低于ELISA的检测下限，因此无法有效检测。研发过程陷入停滞。
Ionis公司通过SMC单分子检测平台很好地解决了研发的瓶颈。由于SMC平台超越性的灵敏度，脑脊液中的微量SMN蛋白可以被有效定量。更为重要的是，从小鼠这种药物研发常用的模型中取出的脑脊液的量是非常有限的，对检测技术的上样量和灵敏度提出了更高的要求。在整个研发过程中，包括小鼠等模式动物的前期实验，直到临床实验，都使用了Erenna来进行数据获取。研究数据显示，通过单次脊髓给药，利用反义核酸修正SMN2的剪接就能达到很理想的效果，会增加SMN蛋白的表达量（图三）。借此药物从动物实验进入临床实验。而在临床实验中，在给药85天后进行脑脊液中SMN蛋白检测。对照组并未出现明显变化。而实验组所有8个患者均出现了SMN上升，说明药物在临床实验中也产生了明显的药效（图四）。
Ionis制药公司于2016年4月通过在美国神经病学学会（AAN）温哥华会议上公布了Nusinersen的二期临床试验数据。试验进行顺利，没有负面事件发生。患病婴儿生存率、肌肉状况表现良好。Nusinersen在药物安全性和毒理学方面表现也正常。Nusinersen在药物研发方面的顺利进展为治疗这种令人恐怖的疾病带来了全新的希望。
图三、Nusinersen的治疗机理。利用反义核酸修正SMN2的剪接会增加SMN蛋白的表达量
图四、Nusinersen产生的治疗效果（脑脊液中SMN蛋白的绝对变化量）。Cohort1和2为隐性对照组，Cohort3为9 mg剂量单次给药的效果。在给药85天后进行脑脊液中SMN蛋白检测。Cohort1和2并未出现明显变化。Corhort3所有8个患者均出现了SMN上升
应用实例二、SMC在哮喘单抗药物研发中的应用
IL-13是重要的细胞炎症因子，近年来一项突出的发现是，青壮年的哮喘很多是由于IL-13信号通路所造成，因而IL-13因子被认为是一种很重要的成年哮喘诱发因素（图五）。Pfizer辉瑞制药公司为解决这种问题，打算开发IL-13单克隆抗体药物来阻断IL-13同其受体的结合。在药物研发过程中两个candidate药物，即IMA638和IMA026获得了比较好的疗效，但临床实验急需方法来测量血液中的IL-13来进行药物代谢动力学和药物效应动力学的检测。这些关键的数据对于药物通过临床实验，进入FDA审批阶段起着至关重要的作用。而当时普通的ELISA受制于较低的灵敏度，根本测不到本底的IL-13表达水平。
辉瑞的研发人员了解到SMC平台的超高检测灵敏度后决定一试，通过跟SMC的研发工程师合作，开发了IL-13检测项目，并且获得了数倍乃至上百倍于高质量ELISA检测试剂盒的灵敏度（图六）。磁珠孵育系统达到了0.07pg/mL的超高检测灵敏度，实现了所有个体本底表达水平的检测，从而得到了血液中IL-13在治疗条件下的完整变化数据，为临床实验提供了关键的临床证据（图七）。IMA638成功地通过了FDA的认证并且上市，也就是后来大家所熟知的anrukinzumab. 在新药研发过程中，药物效应动力学和药物代谢动力学是必备的数据。Erenna平台卓越的高灵敏度检测能力能够很好地满足从健康个体到病患，从正常条件到发病条件各种情况下因子的检测需求，为药物研发提供了非常有力的支撑。
图五、青壮年哮喘的致病机理
图六、IL-13不同检测方法的灵敏度和检出效率对比，包括ELISA方法，以及基于磁珠孵育的单分子检测试剂盒（Bead Based Assay）和基于96孔板进行孵育的单分子检测试剂盒（Plate Based Assay）
图七、单抗药anrukinzumab开发过程中获取的关键血清学数据
应用实例三、SMC在药动学和药效学研究中的应用
药物代谢动力学pharmacokinetics，简称药动学PK，指体内药物浓度与时间的关系。药物效应动力学pharmacodynamics，简称药效学PD，指体内药物浓度与作用效应强度的关系。传统方法的对药物代谢动力学和药物效应动力学提供了很有限的检测容量，例如，经常无法检测到很多药物的完整消除动力学。不仅如此，在低浓度给药，例如微剂量研究中，对于药物也很难检测。Erenna单分子免疫检测技术能够在更低剂量浓度给药时仍提供完整的药代学和药效学曲线，获取用传统方法很难检测的特殊药物消除模式。
我国的国家食品药品监督管理总局，通过CFDA《药物临床药代动力学研究技术指导原则》对药动学的分析方法要求提出了非常明确的分析要求（图八），例如对检测定量下限（Lower Limit of Quantification）提出了明确的界定。主要要求为在保证数据精密度（CV<20%）和准确度（回收率80%-120%）的同时，能够测定给药后5个半衰期时体内药物的终浓度。这对分析技术提出了极大的挑战。
在真实的研究案例中，研究者在大鼠的血清中检测心脏肌钙蛋白I，即cTnI, 来进行药物代谢动力学检测。普通ELISA方法对于cTnI的定量下限大约是30pg/mL, 这意味着给药后不久，体内药物浓度就会迅速落入定量下限以下，无法完成完整曲线的绘制（图九）。传统的解决方法可以采用样品浓缩的方法，但其中基质浓度变化产生的效应，以及在浓缩过程中造成的浓度变化难以掌控。另外的方法包括提高初始给药浓度，即使用特别高的给药剂量。这时即便经过5个半衰期药物在体内的终浓度仍有可能在30pg/mL以上。但是这时给药的浓度并非是药物的合适作用浓度，会有明显的毒性，数据的价值因此会大打折扣。而如果使用Erenna单分子免疫检测技术，cTnI的定量下限大约会到达0.4 pg/mL, 研究者能因此轻松获取曲线后半段的检测数据，绘制整个药物代谢动力学曲线，有利于通过CFDA的认证。
图八、CFDA《药物临床药代动力学研究技术指导原则》对药动学的分析方法要求
图九、药物代谢动力学绘制对定量下限的要求。
药物效应动力学是判断药物效应的主要依据。最主要的工作是绘制量效曲线，说明在一定给药剂量条件下机体的治疗反应，借此能得到的最重要的数值是EC50，是给药浓度的重要依据。在新药研发过程中可以以某种蛋白生物标志物在体液中的出现来作为反应的标志。如果依靠传统ELISA方法，受限于较低的检测灵敏度，观察到标志物出现的时机较晚，此时药物浓度已经比较高，因此会得到较靠右的量效曲线。此时虽然药物能发挥作用，但其实由于药物浓度较高，会出现较强的反作用，EC50实际上被夸大。而当研究者换成Erenna单分子免疫检测技术时，灵敏度相较于ELISA提高了约100-1000倍，可以在生物标志物刚出现时就有效检测，而此时给药浓度还很低。这时归化以后得到的量效曲线会偏左，亦即量效曲线发生了“左移”。得到的EC50也明显降低。也就是说，使用较低的给药浓度达到了跟之前很高给药浓度同样的治疗效果（即半最大效应）。此时药物的反作用很小，这对于提高用药安全性、降低药物对于机体的毒副作用有重要的意义。对于药物通过毒理学测试也很有帮助。
图十、高灵敏度检测产生量效曲线左移
应用实例四、新蛋白药物/治疗方法的免疫原性检测
随着生物技术的发展，重组蛋白药物或者单抗类药物，以及CAR-T等新型治疗方法越来越被人们所看好。但这些治疗过程因为会在体内产生新的免疫原，有可能导致大量细胞因子的释放，引起血管透性变化，病人出现高烧等一系列严重的反应，甚至休克死亡。在著名的CAR-T治疗范例，即怀特黑德·艾米莉的身上，CAR-T细胞造成的IL-6严重高表达层险些造成她的死亡，如果不是抗炎性药物的介入，恐怕人类CAR-T治疗的历史会被推迟相当长的一段时间。在这些创新的疗法中，免疫原性检测被作为药物安全评价的最主要指标。
免疫原性指的是抗原激发免疫反应的能力。也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应的能力。免疫原性很多情况下是对机体有利的，例如疫苗产生的免疫反应；但是，在生物治疗过程中，对治疗性抗原（重组蛋白，单抗）的免疫反应是非常不利的，会产生细胞因子释放综合症cytokine release syndrome (CRS)这种临床副作用，促炎症因子在治疗中被免疫细胞释放 (例如TNF-α, IL-6, IL-8, IFN-γ, 等等)，或者是抗药性抗体产生 anti-drug-antibodies (ADAs) ，削弱治疗效果，对治疗产生反作用。
细胞因子释放检测一般采用全血测试方法。即将治疗性抗体与抗凝全血孵育，并在血浆中检测特定细胞因子的产生。
SMC在细胞因子释放检测方面体现了很高的检测价值，其高检测灵敏度可达到 TNF-α : 0.1 pg/mL ，IL-2: 0.2 pg/mL，以高灵敏度为基础，本底细胞因子水平: 100% 可被检测，提高了数据质量，并且可通过本底水平对样品进行分级。而其大动态检测范围能力可满足在CRS中炎症反应细胞因子剧烈变化，同时高通量的实验形式可检测大量实验样本，减小个体差异对结果的影响。
图十一、细胞因子释放检测：全血测试方法
图十二、全血测试方法得到的细胞因子释放反应
