应用CTC评估手术疗效及锁定与肿瘤快速复发密切相关的术后CTC亚类细胞，近年来已受到人们的广泛关注。

肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一。2015年中国肝癌发病率和死亡率均占据了亚洲所有国家总和的70% (Chen et al., 2016 CA Cancer J Clin 66:115)。手术切除是早期肿瘤治疗的首选方案，然而手术效果对于不同患者而言，差异颇大。以肝癌为例，高达76% 的肝癌患者术后可发生快速复发 (Portolani et al., 2006 Ann Surg 243:229) ，这也是肝癌患者生存期较短的主要原因。

有关CTC在肿瘤转移与复发过程中的重要作用已有很多报道。国外最新的研究发现，不同瘤种的肿瘤患者（如肺癌、乳腺癌、食管癌）手术后仍可检测出CTC，且这些CTCs与肿瘤早期复发的相关性已得到证实（Sandri et al., 2010 Ann Surg Oncol 17:1539；Bayarri-Lara et al., 2016 PloS One 11:e0148659）。然而有关肝癌患者术后CTC与肿瘤快速复发的相关性研究一直处于空白。

最近，由清华大学北京长庚医院肝胆胰外科、病理科、北京大学肿瘤中心（北京肿瘤医院）消化道肿瘤科、解放军301总医院肝胆疾病中心及赛特生物(Cytoingelligen/中国医药城, Cytelligen/USA) 紧密合作，利用赛特SE-i•FISH^® 技术平台，在国际上首次成功对肝、胆肿瘤患者手术前后各种CTC亚类细胞(CD31^-) 进行动态监测，并锁定了与肝癌快速复发相关的术后CTC亚类细胞。研究发现，大部分(高达67%)肝癌CTC为小细胞 (直径≤5 微米白细胞)，患者术后检测出的8号染色体三体小细胞CTC数量 (cut-off: ≥5 CTCs/6 ml 血液)、8号染色体多体EpCAM⁺循环肿瘤干细胞 (CTSC) 数量和癌栓 (肿瘤细胞团, CTM) 数量 (cut-off: ≥1)，均与肝癌患者术后无病生存率(Disease-Free Survival, DFS) 及快速复发密切相关。该研究成果刚刚发表在Cancer Letters杂志上(Wang et al., 2017 Cancer Lett 412:99-107 )。

对于肝癌细胞而言，EpCAM 为干细胞标示物，只表达在少数肿瘤干细胞上 (Terris et al., 2010 J Hepatol 52:280；Munz et al., 2009 Cancer Res 69:5627)，而以CellSearch为代表的阳性捕获技术只能偏见性地检出EpCAM 及角蛋白CK双阳性的CTC细胞，因此该技术手段只可对肝癌部分CTC进行检测，且对于其它瘤种的CTC检测也会造成不可忽视的大量假阴性，已远远不能满足人们客观、全面研究CTC的迫切需要。

全新优化的适于检测肝癌等实体瘤CTC的瘤标-i•FISH^® 技术   

FISH方法是病理科广泛开展的用于检测肿瘤细胞的常规手段。首先，本研究在赛特SE-iFISH技术平台的基础上 (由磊等 2017，临床与实验病理学杂志 33:297; Lin 2015, Clin Transl Med 4:38)，针对肝癌等CTC的特点及临床不同需求，进一步优化了EpCAM、PD-L1、Vimentin、CK等多重瘤标iFISH系列检测系统，以达到同步、原位检测肝癌等实体瘤CTC上多重肿瘤标示物蛋白表达与异常染色体的目的。

鉴于肝癌细胞上干细胞标示物EpCAM表达的特殊意义，本研究应用优化的EpCAM-iFISH，并借助Metafer-i•FISH^® CTC全自动扫描与分析系统，在有效区分外周血中异倍体CEC (CD31⁺) 与CTC (CD31^-) 的基础上，对肝癌、胆管细胞癌患者手术前、后系统性地进行了CTC检测，并首次发现术后CTC与肿瘤快速复发密切相关。

各CTC亚类细胞在手术前、后的数量变化及比例分布

本研究分析统计了各亚类CTC在手术前后CTC总数中的比例分布，其中，EpCAM⁺ 循环肿瘤干细胞(CTSC) 占总检出CTC的9%。同时，文章对比了手术前后EpCAM⁺循环肿瘤干细胞、EpCAM^- 异倍体CTC及循环肿瘤细胞栓 (CTM) 的数量，结果发现，患者术后除CTSC数目有明显下降外(图D)，其余各种CTC亚类细胞及癌栓的数量并没有随着原发肿瘤灶的切除而显著降低。

近年来，有关术后CTC的来源已成为肿瘤界同行日益关注的焦点。除去手术过程本身可能造成肿瘤细胞释放入血外，术后存留的CTC也许并不全都来自于这些切除的实体瘤，一部分可能来源于“早期播散型冬眠肿瘤细胞”(dormant early disseminated cancer cells, eDCCs)。eDCCs在肿瘤形成的初始阶段即已存在于血液或潜伏在不同器官的组织中，它们可能永远处于冬眠状态而不致瘤，也可能被特定因素唤醒、激活，从而造成全身广泛的肿瘤转移(Harper et al., 2016 Nature 540:558; Aguirre-Ghiso et al., 2013 Nat Med 19:276)。需要特别指出的是，8号染色体异常扩增(异倍体)已被证实为是唤醒冬眠肿瘤细胞的主要因素之一 (Hosseini et al., 2016 Nature 540:552)。因此可以合理地认为，本研究检测出的术后肝癌CTC，部分可能属于被唤醒的冬眠肿瘤细胞。

大部分肝、胆肿瘤患者手术前后CTC检出均为阳性，且过半的肝癌患者术后快速复发，有鉴于此，本文对手术前后肝癌CTC及其临床意义进行了深入研究，结果发现肝癌患者术前CTC与病理分期高度相关，而术后CTC数目与肿瘤复发密切相关。

肝癌患者术前染色体三体CTC及癌栓CTM数量与病理及临床分期相关

如上图所示，肝癌患者手术前检测出的较高8号染色体三体(trisomy 8) CTC数量 (A, ≥5 CTCs/6 ml 血液)及CTM阳性数量(B, ≥1) 与患者微血管癌栓、病理分期Edmondson stage III-IV、肝癌临床晚期分期 (巴塞罗那BCLC stage B+C) 密切相关。

手术后CTC、CTSC及癌栓CTM数量与肝癌快速复发密切相关

本研究进一步分析了不同亚类CTC与术后肝癌复发的相关性。结果显示，手术后一周患者检出的8号染色体三体CTC数量≥5/6 ml 血液、阳性检出EpCAM⁺循环肿瘤干细胞CTSC(≥1) 或CTM(≥1)，均与肿瘤患者快速复发、较短的无病生存率DFS密切相关。


肝癌小细胞CTC检测的特殊临床意义

肝癌患者手术前后检出的CTC 大部分为小细胞 (≤5 微米白细胞) ，且手术前后小细胞CTC均维持了67%的较高比例，中位数由术前2升为术后4个细胞，而胆管细胞癌(cholangiocarcinoma, CC) 小细胞CTC的比例由术前的53.3%降低为术后的24%，中位数也相应地由7降为5个细胞。

结论

▶  本研究证实SE-i•FISH^®可同步检测肝癌等实体瘤CTC (CD31^-)  的异常染色体、及对调控细胞起决定性作用的各种肿瘤蛋白表达，而非检测细胞内“DNA→mRNA→蛋白质”生物链中的过渡性中间产物mRNA

▶  大部分肝癌患者手术前后均可检测出CTC，但术前与术后CTC具有不同的临床意义，术前CTC数量与肿瘤病理分期及肝癌临床晚期分期高度相关，而术后CTC数量与肝癌快速复发密切相关

▶  大部分肝癌CTC 为小细胞 (≤ 5 微米白细胞)，且手术前后小细胞所占的高比例基本维持不变

▶  本研究在术后肝癌患者体内首次锁定了与肿瘤快速复发密切相关的CTC亚类细胞，并确定了相应阈值：1) 8号染色体三体小细胞CTC (≥5/6 ml 血液)；2) EpCAM⁺ 循环肿瘤干细胞 CTSC (≥1)；3) 循环肿瘤细胞团 CTM (≥1)。此外，术后8号染色体三体小细胞CTC较术前呈增加的变化趋势亦与肝癌快速复发密切相关 

本研究及国外的多个临床实验已证实，肝癌等实体瘤患者术后体内存在与肿瘤预后、复发等密切相关的CTC亚类细胞。与检测血浆中不具生物活性的残留核酸片段ctDNA不同，实时监测具有细胞及生物活性的CTC，可为患者手术后进一步开展个体化精准治疗、监测肿瘤复发等提供重要参考依据。