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为什么要做动力学水平的相互作用?-----从最近发表的CNS谈起
来源: | 作者:fortebio 陈老湿 | 发布时间: 2019-04-06 | 413 次浏览 | 分享到:

在过去一个月内(2017年11月)发表的CNS中,2篇Science,1篇cell,1篇Nature都不约而同的应用了基于生物膜干涉技术(BLI)的动力学水平的相互作用数据。于是陈老湿又兴奋了,为什么此类的技术如此热门呢?便立即下载下来拜读了一下。


动力学水平的相互作用,就是基于非标记实时的结合和解离曲线下,获得结合常数,解离常数,亲和力常数等参数的研究方法。比起pull-down等传统方法,BLI可以更定量化的直接描述相互作用,给后续结合模型的分析提供更多准确的信息。目前也只有BLI和类似技术能做到,此外BLI还具备速度和成本优势,所以BLI技术产品在科研和工业领域迅速兴起。



与其说越来越多的高IF文章引用了BLI技术等动力学水平的相互作用数据,还不如说动力学水平的相互作用数据使得文章的分量越来越足,我们通过分析这几篇文章中的动力学水平相互作用的地位,从而了解为什么要做动力学水平的相互作用。


1)第一篇文章


Ubiquitination and degradation of GBPs by a Shigella effector to suppress host defense发表于NAUTRE,来自于北京生命科学研究所邵峰实验室


这篇文章主要揭示病原细菌抑制宿主天然免疫防御新机制。


志贺氏痢疾杆菌感染会特异地引起宿主细胞内hGBP1蛋白的降解,通过在志贺氏杆菌中进行全基因组转座子突变体筛选,发现ipaH9.8基因突变会导致hGBP1蛋白降解表型的消失。他们进一步通过一系列细胞水平的细菌感染实验和体外生物化学实验,发现IpaH9.8可以直接结合在hGBP1蛋白上,并催化形成K48连接的多泛素链,进而导致hGBP1通过蛋白酶体通路被降解。当IpaH9.8不存在或其识别GBP的氨基酸残基被突变时,一部分GBP家族的蛋白会定位到胞内志贺氏菌上来抑制其生长。在小鼠感染模型中,当被ipaH9.8基因缺失的志贺氏菌感染后,小鼠可以存活,但是经野生型志贺氏菌感染后的小鼠死亡。


这篇文献主要做了细胞影像学,体外生物化学实验和小鼠实验。而体外化学实验包含了pull-down实验和BLI实验,其实两者都是做结合,只不过前者是定性和间接的,而后者是定量和直接的,可以说BLI是对相互作用一锤定音的实验。为了拿到BLI数据,该课题组专门去了中科院生物物理所用BLI,并且只花了很少时间便拿到了可信的结果,这个是传统方法很难做到的。如果没有BLI的定量性质的数据,陈老湿想这篇文章可能不会发NATURE上了。


2)第二篇文章


发表于Science的来自于巴斯德研究所结构病毒学部门的


A glycerophospholipid-specific pocket in the RVFV class II fusion protein drives target membrane insertion,揭示裂谷热病毒感染宿主细胞机制。


这些研究人员描述了这种机制,即:病毒用来将它的一种包膜蛋白插入到宿主细胞膜中并促进细胞膜融合。他们也确定出这种新的包膜蛋白-脂质复合体的原子结构,并证实这种包膜蛋白具有一种特异性地识别组成细胞膜的一些脂质的亲水性头部的“口袋”。重要的是,这种“识别口袋”不仅在裂谷热病毒的包膜蛋白中发现,也在由节肢动物传播的其他病毒(如登革热病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒,这些病毒近年来已经在世界范围内造成严重的流行病)的包膜蛋白中发现。




文章主要用了蛋白结构学常用的方法,比如电镜与晶体学研究,但是蛋白与脂质体相互作用分子水平数据是这篇文章的核心,所以作者不仅做了BLI,也做了类似BLI的技术一同证明蛋白和突变的蛋白与脂质体的结合,两种方法的结果是吻合的。这种蛋白与脂质体的结合不能用传统基于蛋白-蛋白相互作用的pull-down方法检测,而BLI技术是检测为数不多的蛋白-脂质体相互作用的方法之一,可以说是最简便的方法,动力学数据在一个小时后就可以生成。


3)第三篇文章


Science杂志在线刊登了第二军医大学医学免疫学国家重点实验室王品教授(中国工程院院士曹雪涛研究团队)题为“An Interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism”的文章,阐述了病毒感染调控的新机制。


他们从基因组中表达量很高但功能却未知的非编码RNA入手,筛选到其中一个lncRNA—lncRNA-ACOD1,其在体内外均能显著的促进多种病毒的复制。经过深入研究,团队发现,lncRNA-ACOD1通过不依赖干扰素的一条新作用模式促进病毒感染,表达谱检测显示代谢通路受到lncRNA-ACOD1的明显调控。


在分子机制上,lncRNA-ACOD1在细胞浆的结合代谢中与重要的氨基转移酶GOT2,在分子构象上靠近酶底物结合位点,有利于其催化反应。体外酶活性实验和体内LC-MS质谱代谢物检测证实,lncRNA-ACOD1能够促进GOT2的代谢活性,且GOT2缺失则lncRNA-ACOD1促进病毒复制的功能丧失。实验证实,lncRNA-ACOD1通过促进GOT3酶的活性影响代谢,促进了病毒复制的作用模式。


这篇文章应用了很多监控病毒侵染的技术,光体外实验的结合实验就应用到了MS,immunoblot,BLI等技术,当然BLI技术更加定量化的,也更可信的揭示了它们之间的相互作用。


4)第四篇文章


发表于Cell期刊上“Membrane Microdomain Disassembly Inhibits MRSA Antibiotic Resistance”一文,被认为是战胜超级细菌多药耐药性的一个重大突破,其发布是非常轰动的。


作者通过能促进抗生素耐药性相关的蛋白复合体(PBP2a)脂筏(lipid raft)的微结构域(FMMs)的解析,发现它是由flotillin蛋白和一种特殊的磷脂Staphyloxanthin构成。


然后这些研究人员选择一组能够让这些脂筏解体的分子(他汀类分子)。这类药物能破坏甲戊二羟酸途径,从而影响构成FMMs的脂类和胆固醇的合成,为此类药物成为抗生素的辅助药物开辟了理论基础。




生物膜干涉技术实验显示flotillin蛋白主要和磷脂Staphyloxanthin结合,而和其他细胞膜的磷脂结合比较弱。


当然其他BLI数据还揭示了flotillin蛋白与磷脂的主要结合结构域。因为考虑到文章中大量应用了BLI数据,所以作者还别出心裁的用图文把BLI上的检测方法描述了一遍。可见,BLI数据在这篇文章中的地位。



可见,作者主要用传感器固化磷脂与蛋白(液相)做相互作用。


与第二篇类似,也是做蛋白和脂质体的研究。实验操作非常简单,用APS传感器(一种基于疏水固化的传感器)直接固化脂质体,并与蛋白相互作用,其中脂质体和蛋白都不需要标记。文章中也有少量Liposome Flotation Assays(脂质体浮选实验)的间接定性数据,在分子水平相互作用实验还是以BLI为主。


可以看到这四篇文章都是揭示微生物感染的机制,其中两篇是中国人写的哦。记得某人曾经把机理研究分成三个水平,第一水平是揭示表象,比如发现某个蛋白在某个疾病表达高;第二个水平是初步揭示机理,比如这个蛋白影响哪个信号通路;第三个水平就是分子机制,比如这个蛋白和那个物质结合,产生了哪些一系列的效应。而这四篇文章都把分子机制揭示的非常透彻了。其中BLI技术就是一种很好的揭示分子作用机制的工具。


所有机制都是从分子的相互作用开始,如果想发CNS,就试试BLI技术吧!


引用文献


1)http://nature.bio1000.com/immunology/201710/3971.html

Nature:北生所邵峰研究组揭示病原细菌抑制宿主天然免疫防御新机制


2)http://med.sina.com/article_detail_103_1_36799.html

揭示裂谷热病毒感染宿主细胞机制,源自于生物谷


3)http://www.medsci.cn/article/show_article.do?id=56da11e99159

Science丨曹雪涛组阐述病毒感染调控的新机制,来自于Bioart









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