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触手可及的无核酸酶水
来源: | 作者:xinrui2018 | 发布时间: 2019-05-20 | 1431 次浏览 | 分享到:
    核酸酶通过减切核酸骨架中的磷酸二酯键来降解DNA和RNA。 虽然有些核酸酶是有用的研究工具,但是通常科学家需要完整的生物样品信息用于PCR,克隆,测序或基因编辑等应用。因此,研究核酸的科学家需要不含核酸酶的试剂和容器。水作为缓冲液和试剂的主要成分,也应该不含有核酸酶。

    可是,核酸酶在实验室中普遍存在,它们普遍存在于塑料制品和试剂中,甚至可能来自科学家自己(皮肤,唾液等),它们非常稳定,难以灭活。因此,经常使用DEPC处理来消除它们。

    DEPC(焦碳酸二乙酯)是一种有效的非特异性核糖核酸酶抑制剂,用于核糖核酸酶灭活,且已使用了多年。用DEPC对溶液进行化学处理是一种非常有效的方法,但它存在几个缺点:
  • 安全问题。 DEPC是一种疑似致癌物质,因为它可能与嘌呤发生反应,因此需要谨慎使用。此外,如果瓶子在室温中暴露于湿润的空气中,DEPC可能会水解,将会产生二氧化碳,这会增加潜在的危险。
  • 时间和能源消耗。 DEPC和核酸酶之间的化学反应需要一定的时间,为了破坏DEPC,需要对溶液高压灭菌。 而高压灭菌需要消耗大量的水和电。
  • 引入可能影响实验的杂质。 当DEPC在高压灭菌时会水解产生乙醇和二氧化碳(图1)。 乙醇可能与后续的实验步骤中的杂质反应,有可能产生不需要的副产物。 此外,DEPC对腺苷有很强的亲和力,即使只有痕量的DEPC保留在溶液中,它们也可能与腺苷核苷酸发生反应(印迹,PCR反应等)而导致实验结果不准确,痕量DEPC也可能与胺基和硫醇反应。
  • 核酸酶并非从水中直接除去,而是通过与DEPC的化学反应而失活
图1 DEPC的水解引入杂质 
图2 Biopak®滤头中用于超滤的聚砜中空纤维。
    是否存在可避免以上缺点的制备无核酸酶水的方法呢?经过默克纯水研究人员测试超滤可以作为制备无核酸酶水的替代方法,处理方法方便安全。这个过程使用中空纤维根据其孔径分离污染物。一次性滤头内含标称分子量(NMWL)13 000 Da的聚砜超滤纤维(图2)。

    研究人员用超纯水溶解核糖核酸酶A并分成三份:(1)用DEPC处理并高压灭菌;(2)通过Biopak超滤终端进行处理;(3)未处理。 将rRNA加入到每个溶液中,孵育20分钟,然后进行变性琼脂糖凝胶电泳。
图3 rRNA的凝胶电泳结果,所用的核糖核酸酶溶液分别是DEPC处理、超滤处理与未处理。
    图3电泳结果显示当使用超滤过滤核糖核酸酶溶液时,rRNA保持了完整。同时,使用常规DEPC处理核糖核酸酶溶液也能防止rRNA降解。作为对照,当核糖核酸酶溶液未处理时,rRNA被降解。这表明了使用超滤去除核糖核酸酶与通过DEPC处理灭活效果相当。

   许多分子生物学应用都需要无核酸酶的水。与耗时又麻烦的DEPC处理方法不同,通过水纯化系统的超滤终端方式获得无核酸酶的水,是一种安全又便捷的方法。这种方法对科研有很多好处:
  • 按需,方便。当需要时,可以非常容易地生产新鲜纯化的无核酸酶的水。没有必要提前订购瓶装无核酸酶的水,或花时间制备DEPC水。
  • 没有风险。不需要化学品操作。另外,由于没有添加化学物质到水中,所以没有其他试剂干扰的风险。
  • 高纯度无核酸酶的水。超滤技术是从水中直接除去核酸酶而不是仅仅使他们灭活。因为过滤终端被设计成直接连接到水纯化系统的出口,例如Milli-Q®,可以非常方便的获得无核酸酶的超纯水。
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